肚菌作为珍稀食药兼用大型真菌，其种质资源鉴定与选育对产业发展至关重要。本研究以采自铜仁地区的32个可栽培羊肚菌菌株为材料，采用ITS单一基因片段与ITS+RPB1+RPB2+EF1-α四基因联合分析进行物种鉴定比较，检测交配型基因组成，并通过栽培试验评估农艺性状。结果表明，四基因联合分析构建的贝叶斯系统发育树支持率达100%，较ITS单基因分析具有更高鉴定准确性。交配型基因检测显示83.33%（27/32）菌株同时具备MAT1-1-1和MAT1-2-1基因，缺失交配型基因的9个品种不出菇。栽培试验中21号品种产量最高（1428.56±0.00 g/m2），14号品种单菇鲜重最大（40.10±4.75 g）。研究表明，多基因联合分析可准确鉴定羊肚菌物种，完整交配型基因是出菇必要条件，为羊肚菌种质资源评价与优良品种选育提供了科学依据。